Taq酶活性的定義是基于其在特定條件下的催化能力,通常用單位酶活來表示。Taq酶活性檢測方法主要包括以下幾種技術手段:
一、生物發光技術:
1、通過檢測PCR反應中產生的焦磷酸(PPi)間接測定酶活性。具體步驟包括:
2、利用ATP硫酰化酶將PPi轉化為ATP。
3、通過蟲熒光素酶系統發光檢測ATP量。
4、繪制焦磷酸標準曲線計算酶活性。
二、熒光定量PCR:
利用擴增產物的熒光信號強度動態監測活性。
三、絕對活性測定法:
通過dATP消耗量直接計算活性,適用于精準定量。
四、功能標記檢測:
針對特定應用場景的檢測:
使用基因型與表型方差分析評估等位變異類型。
通過POD活性等指標量化酶功能表現。
五、dNTP摻入法:
標準活性定義方法:
1個酶單位(U)定義為在74℃下,30分鐘內催化10 nmol dNTP摻入酸不溶物所需的酶量
通過測定dNTP消耗量或DNA合成量計算活性。
六、質量控制檢測:
包括:
1、核酸內切酶活性檢測(質粒DNA完整性)。
2、非特異性核酸酶活性檢測。
3、宿主DNA殘留檢測(qPCR法)。
不同檢測方法各有優劣,生物發光法靈敏度高但操作復雜,dNTP摻入法簡便但特異性較低,實際應用中需根據檢測目的選擇合適方法。?