內(nèi)毒素ELISA檢測試劑盒是一種用于體外定量檢測生物樣本中內(nèi)毒素（ET）濃度的工具，在科研和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。該試劑盒多基于雙抗體夾心法或競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗技術(shù)。以雙抗體夾心法為例，用純化的內(nèi)毒素抗體包被微孔板制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入內(nèi)毒素，再與HRP標(biāo)記的內(nèi)毒素抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹d洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的內(nèi)毒素呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中內(nèi)毒素濃度。
（1）加樣規(guī)范
樣本處理：
血清/血漿需離心（≥3000 rpm，10分鐘）去除雜質(zhì)，稀釋倍數(shù)參考說明書。
避免反復(fù)凍融樣本，建議單次實驗分裝使用。
加樣順序：
標(biāo)準(zhǔn)品：按濃度從低到高依次加樣，每孔100μL（具體體積以說明書為準(zhǔn)）。
樣本：單孔或雙孔重復(fù)，設(shè)置陰性/陽性對照（如廠家提供）。
空白對照：加入稀釋液替代樣本。
加樣技巧：
緊貼孔壁加樣，避免滴入孔底產(chǎn)生氣泡。
加樣后輕搖板架混勻，但避免劇烈晃動。
（2）孵育與洗滌
孵育條件：
37℃恒溫箱孵育（時間通常30-60分鐘），避免溫度波動。
若室溫過低，需延長孵育時間或使用加熱板。
洗板操作：
棄去孔內(nèi)液體，每孔注入300-400μL洗液，靜置5秒后拍干（避免用力過猛導(dǎo)致微球脫落）。
重復(fù)洗板5次，最后在吸水紙上扣干殘留液。
（3）顯色與終止
顯色底物：
TMB（四甲基聯(lián)苯胺）需避光保存，臨用前等體積混合A液和B液（如H?O?）。
每孔加100μL，室溫避光反應(yīng)（通常10-15分鐘），觀察顏色變化。
終止反應(yīng)：
及時加入終止液（如2M H?SO?），每孔50μL，輕敲板框混勻。
終止后立即檢測OD值（延遲可能導(dǎo)致讀數(shù)偏差）。
